Etapele Proiectului

 

1. Generarea materialului biologic pre-terapeutic

 

2. Definirea loturilor de prognostic.

 

3. Prepararea esantioanelor pentru analiza genomica

 

4. Analiza genica

 

5. Validarea rezultatelor de microarray

 

6. Secventierea pentru genele candidate

 

7. Analiza bioinformatică

 

8. Validarea tehnicilor de Tissue-Array pe limfoganglion in aprecierea prognosticului

 

 

 

1. Generarea materialului biologic preterapeutic

In aceasta etapa se vor include pacienti in studiu, dupa semnarea consimtamantului si se va recolta materialul biologic de analizat.

Centrele in care se va realiza includerea de pacienti in studiu sunt:

– Spitalul Hotel Dieu din Paris, Franta

– Spitalul Europeean Georges Pompidou din Paris, Franta

– Spitalul Allgemeines Krankenhaus–Universitätskliniken din Viena, Austria

 

Tipul de materiale recoltate:

– ganglion mediastinal tumoral – 3-6 criotuburi/pacient

– ganglion mediastinal normal – 6 criotuburi/pacient

– tumora pulmonara – 3 criotuburi/pacient

– tesut pulmonar normal – 3 criotuburi/pacient

– urina – 5 criotuburi/pacient

– sange – 10-11 criotuburi/pacient

Total: 30-34 criotuburi/pacient

 

 

Criterii de Includere

 

– Varsta . 18 ani

– cancer pulmonar cu cellule non-mici suspectat la CT si/sau bronhoscopie

– invazia ganglionilor mediastinali suspectata la CT sau/si TEP scanner

– absenta metastazelor confirmata prin CT de suprarenale, CT cerebral si/sau RMN, TEP

– cancer pulmonar primitiv cu cellule non-mici confirmat la examenul extemporaneu si la parafina pe tesuturile ganglionare mediastinale recoltate cu ocazia mediastinoscopiei:

– ≥ 70% tesut tumoral pe fragmentele de tesut ganglionar mediastinal recoltate

– Semnarea consimtamantului

 

 

Criterii de non-includere

 

–       Varsta > 18 ani, dar incapacitate mentala de a decide, chiard aca aceasta incapacitate este temporara

–       Alte tratamente chimioterapice in anul precedent includerii

–       Refuzul pacientului

 

 

Criterii de excludere

 

–       La cererea pacientului, dupa includere

–       Nerealizarea chimioterapiei neo-adjuvante

–       Oprirea prematura a chimioterapiei neo-adjuvante

–       Clasificare histopatologica dificila

–       Tumora pulmonara secundara la examenul histopatologic definitiv

 

 

 

2. Definirea loturilor de prognostic

 

Definirea celor doua loturi prognostice :

Lotul A – cu raspuns obiectiv la chimioterapia neoadjuvanta

Lotul B cu raspuns minor sau stabilizare la chimioterapia neoadjuvanta.

 

Pentru a cuantifica raspunsul la chimioterapia neoadjuvanta, se vor aplica criteriile OMS de reevaluare (Tabel 1):

 

  Modificarea sumei produsilor diametrelor  
Raspuns Complet (RC) Disparitia leziunilor la 4 saptamani de la incheierea chimioterapiei
Raspuns Partial (RP) Diminuarea cu cel putin 50% a leziunilor la 4 saptamani de la incheierea chimioterapiei
Maladie Stabilizata Lipsa de raspuns (RC sau RP) Lipsa de progresiune
Progresarea Maladiei Cresterea cu cel putin 25% a sumei produsilor diametrelor leziunilor fata de momentul reducerii maxime sau aparitia de noi leziuni

 

Tabel 1. Definirea raspunsului la chimioterapia neoadjuvanta in functie de criteriile OMS.

 

 

 

3.Prepararea esantioanelor pentru analiza genomica – Aceasta etapa se incepe in fiecare centru de chirurgie toracica in care se includ pacienti. Criotuburile se conserva in azot lichid in centrele de recoltare. Probele biologice din toate centrele participante, vor fi transportate initial la Spitalul Hotel Dieu din Paris, unde va fi evaluata cantitatea de tesut tumoral existenta in tesuturile recoltate. Tesuturile ce vor contine > 70% tumora, vor fi apoi transportate la Institutul Clinic Fundeni pentru analiza genica.

 

4.Analiza genica – Aceasta etapa se va desfasura la Institutul Clinic Fundeni. Tehnologia folosita pentru experimentele de microarray este Agilent. Analiza de expresie genica se va face dupa protocoalele one-color microarray. Acest protocol ofera posibilitatea compararii ulterioare a materialului genic studiat si mai ales a realizarii unor comparatii de subgrup, rezultate din analiza initiala. Tehnica de analiza de expresie genica comparativa, protocolul Agilent two-color, va fi utilizata pentru determinarea modificarilor de expresie genica induse in limfoganglioni de catre procesul neoplazic. Aceste expresii genice modificate vor constitui expresii genice tinta ce vor fi ulterior urmarite in evolutie in functie de impactul chimioterapiei.

5.Analiza bioinformatică Softuri specializate de tratare a bioinformatiilor obtinute prin microarray permit in urma unor procedee complexe, determinarea calitativa a gradului de expresie genica. Aceasta etapa este momentul determinant in asocierea expresiilor genice cu un moment evolutiv sau stare functionala celulara.

 

6.Validarea rezultatelor de microarraySe va realiza prin tehnici de Real Time Polymerase Chain Reaction, in Laboratorul de Genomica al Institutului Clinic Fundeni si va permite validarea si cuantificarea genelor rezultate din analizele preliminare de microarray. Aceasta etapa este necesara in alegerea genelor candidate pentru secventiere si identificarea lor.

 

7. Secventierea pentru genele candidatese va realiza prin folosirea unei tehnici Sanger clasice, folosind ABI Prism Big Dye Terminator technology dupa amplificarea genice si purificarea ampliconilor. Analiza de secventiere va fi realizata dupa purificare cu BigDye®XTerminator TM folosind analizorul genetic ABI PRISM 3130. Fiecare amplicon va fi secventiat de trei ori. Aceasta etapa este necesara pentru identificarea genelor a caror expresie este modificata.

 

8.Validarea tehnicilor de Tissue-Array pe limfoganglion in aprecierea prognosticului

Aceasta etapa reprezinta o noutate fata de metodologiile de expresie genica actuala. Tehnica de Tissue-Array este ultima venita in arsenalul genomicii si are avantajul de a permite analize de expresie genica pe tesuturi incluse la parafina. Acesta metoda permite deci realizarea unui profil genic rapid si economic, insa este o metoda inca in curs de evaluare. Compararea rezultatelor obtinute prin tehnica standard de microarray cu cele obtinute pe aceleasi specimen prin tehnica de Tissue-Array, va permite validarea acestei din urma tehnici in analiza de expresiei genice pe limfoganglioni, in cancerul pulmonar. Este un pas inainte important in popularizarea analizei de expresie genica si aducerea ei la patul bolnavului, ca o interfata laborator-pacient.